СТЕПАНОВ А. д.м.н., СВИРИДОВ Л. д.м.н., проф.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ГРВ-ГРАФИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО

НИИЦ (МБЗ) ГНИИИВМ МО РФ

В настоящее время осуществляется широкий поиск сфер применения газоразрядной визуализации (ГРВ) в биологии и медицине. Исходя из известного факта о способности этого метода улавливать изменения физико-химических характеристик растворов неорганических веществ и биологических жидкостей, нами предпринята попытка изучить возможность применения газоразрядного свечения для регистрации специфического взаимодействия антигена с комплементарным антителом – так называемой реакции агглютинации. Это и определило цель настоящего исследования.

Для реализации поставленной цели использовали разработанную авторами метода технологию оценки характеристик газового разряда вокруг капли, находящейся на конце канюли одноразового инсулинового шприца и получаемой путем выдавливания из него исследуемого материала. Из каждой пробы записывали показатели 10 капель с частотой 30 кадров в секунду и продолжительностью воздействия электромагнитного поля 10 сек. Итоговые данные ГРВ сравнивали с результатами, полученными общепринятым методом – визуальным.

Специфические антитела получали путем иммунизации кроликов яичным альбумином или туляремийной вакциной и белых мышей специфической вакциной. Кроме этого, использовали сыворотку крови человека, переболевшего инфекцией, вызванной условно-патогенным бактероидом B . fragilis .

Для постановки основных опытов первоначально необходимо было оптимизировать схему проведения анализа с помощью ГРВ. В частности, требовал решения вопрос, касающийся того, необходимо ли размешивать осевший на дно пробирки комплекс антиген-антитело. Эта часть работы была выполнена при использовании следующих комплементарных пар реагентов:

•  яичный альбумин + антитела к нему (сыворотка крови иммунизированных альбумином кроликов);

•  вакцинный штамм специфического вируса + антитела к нему (иммуноглобулин против вируса, полученный из асцитической жидкости белых мышей, привитых соответствующей вакциной);

•  туляремийный антиген + антитела к нему (сыворотка крови кроликов, привитых туляремийной вакциной).

При использовании указанных системах были получены однотипные данные. Оказалось, что даже при осторожном размешивании осадка (агглютината) результаты ГРВ-анализа не только не совпадали с таковыми при визуальном учете реакции, но нередко имели противоречивый характер.

В случае исследования с помощью ГРВ надосадочной жидкости без предварительного перемешивания в ней осадка результаты совпадали с данными визуального учета реакции агглютинации. Как нам представляется, при положительной реакции комплекс антиген-антитело оседает и надосадочная жидкость «очищается» от компонентов реакции. При отсутствии агглютинации компоненты реакции находятся во взвешенном состоянии, то есть очищения (просветления) надосадочной жидкости не происходит. Возникающие при этом видимые (просветление надосадочной жидкости) и невидимые (изменение физико-химических свойств) различия в опытных и контрольных (заведомо отрицательных) пробах фиксирует метод ГРВ, указывая тем самым на положительную реакцию агглютинации.

С учетом этих данных в последующем были выполнены развернутые эксперименты, подтверждающие это в общем виде сформулированное положение. Один из этих опытов был выполнен с использованием следующих реагирующих компонентов:

•  Сыворотка крови человека, в которой были антитела к B . fragilis в титре 1:640 (сыворотка № 1);

•  Сыворотка крови человека, в которой антитела к B . fragilis отсутствовали (сыворотка № 2);

•  Взвесь В. fragilis (антиген);

•  Физиологический раствор (0,85 % раствор NaCl).

Схема опыта представлена в табл. 1.

Таблица 1

Схема опыта

Примечание: * цифрами обозначены номера проб.

Исследование проб 1,2 и 3 (соответственно физиологический раствор NaCl , тот же раствор с добавление или B . fragilis , или сыворотки крови №1) предусматривало выяснить, может ли ГРВ-метод выявить в растворе такие микроскопические объекты, каковыми являются антитела и микроорганизмы.

При сравнительной оценке ГРВ-грамм этих трех объектов было установлено, что проба 1 достоверно отличалась от пробы 2 по интенсивности свечения и по площади засветки (рис.1), а от пробы 3 – не только по этим критериям (рис.2 и 3), но и по коэффициенту формы (рис.4) и длине изолинии (рис.5). По всем названным показателям достоверно отличались между собой и пробы 2 и 3 (рис. 6 и 7). Все это, как нам представляется, свидетельствует о том, что использованный метод позволяет улавливать присутствие в физиологическом растворе таких биологических объектов, как микроорганизмы, являющиеся в данном случае моделью антигена, и иммунная сыворотка, содержащая специфические антитела к этим микроорганизмам. Кроме того, выявляются различия между сывороткой крови и взвесью микроорганизмов.

Результаты оценки проб 4-9 должны были ответить на главный вопрос: можно ли с помощью ГРВ-метода установить не только наличие в физиологическом растворе антигена или антител к нему, но и специфическую реакцию между ними – реакцию агглютинации. Теоретически это представляется возможным, поскольку при таком взаимодействии образуются новые биологические структуры (иммунные комплексы), обладающие сами по себе другими физико-химическими свойствами, чем исходные реагенты (антигены и антитела), и, по всей вероятности, изменяющие эти же характеристики раствора, в котором они находятся.

Главной (опытной) из всех проб является проба 4, которая состоит из сыворотки крови человека с антителами к B . fragilis , разведенная физиологическим раствором до титра 1:10, и взвеси B . fragilis . Реакция агглютинации в такой системе неизбежна в силу комплементарности (специфичности) взятых биологических реагентов, что подтверждалось визуально через 24 ч (на момент снятия ГРВ-грамм).

Контрольная проба 5 отличалась от пробы 4 лишь тем, что в ней сыворотка крови была в разведении 1:1000. В данном случае реакция агглютинации не происходила, так как разведение сыворотки (1:1000) превышало ее максимальный титр (1:640).

При сравнении ГРВ-грамм проб 4 и 5 было установлено, что они существенно различаются по интенсивности свечения (рис.8). Поскольку их отличие лишь в том, что в одной из них была реакция агглютинации (проба 4), а в другой (проба 5) – она отсутствовала, то это может служить доказательством способности метода фиксировать новое физико-химическое состояние пробы 4, возникшее в результате специфического взаимодействия содержащихся в ней антигена и антител. Иными словами – метод визуализирует реакцию агглютинации.

Другим доказательством правомочности такого вывода являются:

- достоверные различия по интенсивности свечения (рис.9) между пробами 4 и 6 (агглютинация в пробе 6 отсутствовала в связи с недостаточной экспозицией смеси компонентов: смешивание проводили непосредственно перед снятием ГРВ-граммы, то есть реакция агглютинации еще не успела произойти);

- достоверные различия по площади засветки (рис.10), интенсивности свечения (рис. 11) и длине изолиний (рис.12) между пробами 4 и 8(агглютинация в пробе 8 не произошла в связи с отсутствием в сыворотке крови № 2 специфических антител к B . fragilis );

- отсутствие различий между пробами 6 и 7 (в обеих пробах агглютинация отсутствует в связи с недостаточной экспозицией антигена с антителами);

- отсутствие различий между пробами 8 и 9 (в обеих пробах агглютинация не произошла в связи с гетерологичностью антигена и антител).

Таким образом, как следует из представленных данных, сравнительный анализ ГРВ-грамм опытной и контрольной проб позволяет выявлять антитела в исследуемом материале.

Важным представлялось изучить также информативность ГРВ как метода титрования иммунных сывороток. Для этого был спланирован специальный опыт по определению титра антител в сыворотке крови кроликов, привитых яичным альбумином. Схема опыта представлена в табл. 2.

Таблица 2

Результаты титрования сыворотки крови кроликов, привитых яичным альбумином

Сравнительный анализ показал, что ГРВ-граммы проб 1 и 2, близких по выраженности визуально регистрируемой агглютинации в них (4+ и 3+ соответственно), достоверно не отличались. Вместе с тем, проба 1 достоверно отличалась от пробы 3 (агглютинация +) по площади (рис. 13) и интенсивности свечения (рис. 14), а от пробы 4, в которой агглютинация отсутствовала вовсе, - по площади (рис. 15), интенсивности свечения (рис. 16), а также и по количеству фрагментов (рис. 17). Аналогичные отличия наблюдались и при сравнении ГРВ-грамм пробы 2 с характеристиками пробы 3 (рис. 18) и 4 (рис. 19-21). В то же время, компьютерный анализ проб 3 и 4, в которых агглютинация или выражена слабо (проба 3), или отсутствует вовсе (проба 4), не выявил их отличий.

Таким образом, титр антител, определяемый визуальным и ГРВ методами, был одинаков – 1:20. Это дает основание считать, что ГРВ позволяет не только регистрировать наличие антител в жидкостях, но и определять их титр.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные материалы позволяют заключить, что метод ГРВ позволяет выявлять специфическую реакцию антител с комплементарным к ним антигеном, именуемой реакцией агглютинации. В основе метода лежит регистрация динамики показателей газоразрядного свечения во времени – от момента соединения (смешивания) специфических компонентов, каковыми являются антиген и антитела к нему, к моменту завершения их взаимодействия и образования так называемых иммунных комплексов. В результате такого взаимодействия происходит изменение физико-химических характеристик исследованного материала и, как следствие, показателей ГРВ-грамм.

Полученные результаты, безусловно, имеют предварительный характер и нуждаются в дальнейшем уточнении. Но уже сейчас важность этого направления научного поиска нам представляется очевидной.

Метод может найти применение для исследования непрозрачных биологических жидкостей, когда постановка реакции агглютинации в классическом исполнении (с визуальным учетом результатов) не только затруднена, но и невозможна – например, исследование крови с целью выявления этиологии аллергий у человека.